حساسیت شیگلا فلکسنری و استرپتوکوکوس پیوژنز به ژل آلوئه ورا در شرایط برونتنی
آلوئه ورا کاربرد وسیعی در محصولات سلامت پیدا کرده است و برخلاف مطالعات متعدد درمورد کل گیاه، مطالعه کمی روی ژل آن، که کاربرد گستردهای در این محصولات دارد، انجام گرفته است. این مقاله حساسیت دو باکتری به این ماده را تحت شرایط برونتنی تشریح میکند. مقاومت آنتیبیوتیکی جهانی بواسطهی باکتریها در حال تبدیل شدن به یک نگرانی روزافزون در حوزه سلامت عمومی است و تلاشها برای کشف مواد جواد ضدمیکروبی در حال انجام است.
یک روش، شامل بررسی مواد درمانی جدید با مدلهای جدیدِ تاثیر از منابع طبیعی است. گیاهان متعلق به جنس آلوئه (سوسنیان) به خاطر خواص پزشکیشان، قرنهاست که معروف هستند و آلوئه ورا (Aloe barbadensis Miller) از شهرت خاصی برخوردار است. در دهه اخیر، از آلوئه ورا (AV) به طور گسترده در نوشیدنیهای سلامت، کرمهای موضعی، لوازم آرایشی و بهداشتی استفاده شده است و گزارشهای بسیاری وجود دارد که مدعی خواص سودمند آن از جمله برای طیف وسیعی از بیماریها هستند. این ادعاها تا حد زیادی حالت روایی دارند و شواهد علمی اغلب ضعیف و متناقض است.
این تناقضات ناشی از موارد متعددی است از جمله درمانهایی که قبل از انجام مطالعات آزمایشگاهی به کمک این گیاه انجام شده است، مثل بیماریهای ذخیرهای، استفاده از اجزای خشک یا تازه، تنوع در روشهای استخراج، استفاده از بخشهای مختلف گیاه، شرایط رشد، و سن گیاهان موقع برداشت. برگهای تازه آلوئه ورا، گوشتی و آبدار هستند و با کندن این برگها، ژل لعابمانند درون آن نمایان میشود. این ژل، ماده اصلیای است که در بسیاری از محصولات تجاری معروف مورد استفاده قرار میگیرد. تاکنون بیش از 75 ماده فعال در این ژل شناسایی شده است، هر کدام از این مواد، مکانیسم عمل متعددی ممکن است داشته باشد و تاثیری که به کمک سایر مواد (اثر سینرژیک) یا به طور جداگانه میگذارد، خواص درمانی متعدد آن را توضیح میدهد.
این قضیه، یک تمایلی برای جداسازی و تجزیه و تحلیل تک تک مواد ایجاد کرده است تا پتانسیل درمانی ژل آلوئه ورا را به آن ماده نسبت دهد. این بحث به طور ضروری مورد توجه قرار نگرفته است و خصوصا در شرایط درونتنی، مطالعات نتوانستهاند اثرات ضد میکروبی این گیاه را از اثر محرک آن بر سیستم ایمنی تفکیک سازند. اجزای کل برگ نشان میدهد که خواص ضد میکروبی مستقیم دارد از جمله آنتراکینونها و ساپونینها، در حالی که خاصیت ضدمیکروبی غیرمستقیم بواسطهی تحریک لوکوسیتهای فاگوسیتی جهت نابودی باکتریها، به پلیساکاریدها نسبت داده شده است.
از آنجا که مطالعات محدودی درمورد ژل آلوئه ورا انجام شده است، هدف از این مقاله، ارائه شواهدی برای اثبات اثرات ضد میکروبی ژل آلوئه ورا که قبل از انجام آزمایشات گسترده از آن استفاده میشده است، میباشد. هدف نهایی، تلاش برای مشخص کردن عواملی است که فعالیت زیستی دارد. میکروارگانیسم اصلی که در این مقاله مورد استفاده قرار گرفت، شیگلا فلکسنری بود. این باکتری غیرمتحرک و میلهای، متعلق خانوادهی انتروباکتریاسه است. گونههای شیگلا یکی از عوامل مهم بیماری گوارشی هستند که به شکل اسهال آبکی ظاهر میشوند که با پیشرفت این بیماری، اسهال خونی لعابدار و شیگلوز بروز مییابد. در گذشته، درمان آنتیبیوتیکی موثر بود، اما افزایش مقاومت به آنتیبیوتیکهای مختلف به خصوص مقاومت به آمپیسیلین، کلرامفنیکول، نالیدیکسیک اسید و آنتیبیوتیکهای حاوی کوتریموکسازول، نگرانی بزرگی است.
شواهد روزافزونی نیز وجود دارد که درمان آنتیبیوتیکی میتواند علائم بیماریهای گوارشی را تشدید کند و درمان جایگزین، سودمند است. بعلاوه، حساسیت باکتری گرم مثبت استرپتوکوکوس پیوژنز به آلوئه ورا به طور مختصر مورد بررسی قرار گرفت، چون این باکتری، ارگانیسم دیگری است که مقاومت آنتیبیوتیکی نشان میدهد. شیگلا فلکسنری (NCTC 9950) و استرپتوکوکوس پیوژنز GPA (ATCC 19615) از خدمات آزمایشگاهی سلامت عمومی (پورتونداون انگلیس) خریداری شد. از کشتهای پایه (استاک)، کشتهای زیرمجموعه (ساب کالچر) تهیه و در محیط کشت سوی براث معمولی (TSB، شرکت Difco Laboratories Ltd، دیترویت آمریکا) در دمای 37 درجه سانتی گراد نگهداری شدند.
آلوئه ورای خشکانجمادشده (پودر) از آمریکا تهیه شد که حاوی ژل آلوئه ورا بود. این پودر از ژل گیاه آلوئه ورا بدست آمده بود که موقع برداشت، تقریبا 2 ساله بودند. این پودر در محلول نمکی فسفاته با خاصیت بافری (PBS) با PH برابر با 7.5 در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 30 دقیقه بازسازی شد و سپس از فیلتر استریل 0.22 میکرومتری عبور داده شد. برای مقایسه، نوشیدنی Aloe Vera Gel (محصول شرکت forever living products، شهر سکاتسدیل آریزونا) حاوی ژل رقیقنشده و تصفیهنشدهی آلوئه ورا نیز مورد استفاده قرار گرفت.
این محصول از کاغذ فیلتر استریل شمارهی 54 عبور داده شد. امکان تعیین میزان مواد موثری که طی این فیلتراسیون از دست رفت، وجود نداشت. از آمپیسیلین (AMP) به تنهایی و یا به همراه نالیدیکسیک اسید (NAL) (شرکت Sigma-Aldrich Ltd.، شهر پوله انگلیس) نیز برای مقایسه استفاده شد. بدین منظور در محلول نمکی فسفاته با خاصیت بافری (PBS) حل شدند و از فیلتر 0.22 میکرومتری عبور داده شدند. معرفهای مورد استفاده در این مطالعه از این مناطق تهیه شدند: مولر هینگتون براث از شرکت Oxoid در شهر بیزینگاستوک انگلیس، آگار از شرکت Unipath Ltd. در شهر Bedford انگلیس، آلامار بلو از شرکت Serotec Ltd. در شهر کیدلینگتون انگلیس، ظروف پلاستیکی از شرکت Greiner Bio-One Ltd. در استونهاوس انگلیس، پلیت کشت 96 چشمهای از شرکت TPP در تراسادینجن سوئیس و سایر معرفها از شرکت BDH Ltd. در شهر پوله انگلیس خریدار شدند.
جدول 1. مناطق عدم رشد شیگلا فلکسنری در AV ، Aloe Vera Gel، AMP و NAF
| میانگین قطر منطقه عدم رشد ± انحراف معیار (سانتی متر) (n=3) | ||||
| رقت | AV | AVGb | AMP | NAL |
| 1:2 | 0.2C ± 2.8 | – | 0.1c±3 | 0.1±3.5 |
| 1:4 | 0.1c±2 | – | 0.2c±2.8 | 0.1±3 |
| 1:8 | 0.1c±1.5 | – | 0.2c±1.6 | 0.1±2.8 |
| 1:16 | 0.2d±1.3 | – | – | 0.2±2.2 |
| 1:32 | 0.1d±0.9 | – | – | 0.2±1.9 |
| 1:64 | –e | – | – | – |
| چاهکها در نوترینت آگار ایجاد شدند، ماده تست به هر چاهک افزوده شد و لایهای از باکتریهای شیگلا فلکسنری روی آنها ریخته شد. غلظتهای شروع مواد تست: AV: 450 میلی گرم بر لیتر، AVG: 90 درصد حجمی/حجمی، AMP و NAL: 512 میکروگرم بر میلی لیتر.
AVGb: Aloe Vera Gel شرکت forever living products نماد c : عدم رشد معنادار در مقایسه با چاهکهای تیمارنشده (P<0.001) نمادd : عدم رشد معنادار در مقایسه با چاهکهای تیمار نشده (P<0.05) نماد –e : عدم رشد |
||||
مناطق عدم رشد (zones of inhibition) به روش agar diffusion محاسبه شد. چاهکهایی در پلیت نوترینت آگار ایجاد شد و 75 میکرولیتر ماده تست، آلوئه ورا (7 تا 450 میلی گرم بر میلی لیتر) یا آنتی بیوتیک (2 تا 512 میکروگرم بر میلی لیتر) درون هر چاهک ریخته شد. کشت شیگلا فلکسنری به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد انکوباسیون قرار گرفت. قطر مناطق عدم رشد اندازه گیری شد (جدول 1). غلظتهای بیش از 112 میلی گرم آلوئه ورا بر میلی لیتر، 32 میکروگرم AMP بر میلی لیتر، و 128 میکروگرم NAL بر میلی لیتر، در مقایسه با چاهکهای تیمارنشده (شاهد)، منطقه عدم رشد معنا داری نشان دادند (P<0.001). به دلیل مشکلات انتشار در آگار، امکان مقایسه با ژل آلوئه ورا وجود نداشت.
تلاش شد که قبل از رشد شیگلا فلکسنری بر سطح محیط کشت و رسیدن به تعداد ثابت، ژل آلوئه ورا با آگار مخلوط شود، اما آگار نتوانست ببندد و سفت شود که به خاطر وجود پکتیناز بود. منحنیهای رشد طبق اشکال زیر رسم شد. 10 میکرولیتر ارگانیسم (CFU 100) بر روی یک پلیت 96 چشمهای حاوی 100 میکرولیتر TSB در هر چشمه، تلقیح داده شد و به مدت 30 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد انکوباسیون قرار گرفت (سه سری پلیت). پلیت همزده شد و قرائتها با دستگاه Titertek Multiscan MCC/340 plate reader به فاصله یکساعت انجام شد. تعداد باکتریها در هر میلی لیتر با معادله (0.02/108×2×A620 ) محاسبه شد.
منحنیهای رشد نیز با 100 میکرولیتر ماده تست رسم شد: AV (7 تا 450 میلی گرم بر میلی لیتر)، ژل آلوئه ورا (5 تا 90 درصد)، AMP (2 تا 512 میکروگرم بر میلی لیتر)، یا NAL (2 تا 512 میکروگرم بر میلی لیتر). باکتریهای تیمارنشده، در مدت 3 تا 10 ساعت به فاز لگاریتمی رسیدند و حداکثر رشدنشان پس از 22 ساعت بود. تمام مواد تست، هر کدام تا حدی رشد باکتریها را به مدت 24 ساعت متوقف کردند. دوز 50 درصد عدم رشد عبارت بود از 30 میلی گرم AV بر میلی لیتر، 15 درصد (حجمی/حجمی) ژل آلوئه ورا، 3 میکروگرم NAL بر میلی لیتر، و 4 میکروگرم AMP بر میلی لیتر.
با تقلیح 100 میکرولیتر مولر هینگتون براث با 100 میکرولیتر رقتهای دوگانهی AV (در کشت سه تایی) و 10 میکرولیتر شیگلا فلکسنری (CFU 100) و قراردادن در انکوباسیون 37 درجه سانتی گراد به مدت 6 ساعت، عدم رشد ناشی از AV بیشتر شد. چاهکهای شاهد فقط حاوی باکتری (مثبت) یا براث (منفی) بودند. آلامار بلو (10 میکرولیتر) به هر چاهک اضافه شد و به مدت بیش از 2 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد انکوباسیون قرار گرفت. پلیت به مدت 10 دقیقه با دور 12000 سانتریفیوژ شد تا تودهای از باکتریها تشکیل شود و ماده سطحی به یک میکروپلیت جدید منتقل شد.
نمودار 1. اثرات AV و AMP بر رشد شیگلا فلکسنری. شیگلا فلکسنری به مدت 8 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوباسیون، در محیط کشت مولر هینگتون براث با AV (علامت مربع) یا AMP تلقیح داده شد. غلظتهای ماده تست در نمودار x، بر حسب میلیگرم بر میلیلیتر برای AV و برحسب میکروگرم بر میلیلیتر برای AMP نشان داده شده است. از آلامار بلو برای تعیین درصد رشد شیگلا فلکسنری استفاده شد. نتایج به صورت میانگینها ± انحرافهای استاندارد سه قرائت بیان شد.
قرائت های A570 و A600 در اسپکترومتر SpectraMax 190 انجام شد، و رشد درصدی با استفاده از معادلهی ](میانگین تفاضل A570 و A600 ماده تست، تقسیم بر میانگین تفاضل A570 و A600 شاهد مثبت)[100× محاسبه گردید. نمودار 1 پاسخ شیگلا فلکسنری به دوز AV را پس از 8 ساعت نشان میدهد. از آنجا که تست آلامار بلو، یک شاخص رشد رنگسنجی دارد تا فعالیت متابولیکی را تشخیص دهد، برای آزمایشات سمیت سلولی مفید است. این تستها در مقیاس کوچکی در میکروپلیتها تهیه شدند تا ماده کمتری مصرف شود. با این وجود، نتایج مشابه با نتایج آزمایشات در مقیاس بزرگ بود که در آنها از ماده تلقیحی بیش از 105 CFU/ml×5 استفاده شد.
نمودار 2. اثرات AV و AMP بر رشد استرپتوکوکوس پیوژنز. استرپتوکوکوس پیوژنز در دمای در TSB تنها (نماد مربع)، یا با AV (25 میلی گرم بر لیتر) (علامت لوزی) یا با AMP (25 میکروگرم بر لیتر) (علامت دایره) تلقیح شد. تعداد باکتریها با قرائتهای A620 محاسبه شد. نتایج به صورت میانگین مجموع A620 ± انحرافهای استاندارد سه قرائت
بهینهسازی تست آلامار بلو برای میکروپلیت مهم بود، چون آزمایشات پیگیری اولیه نشان دادهاند که استخراج ماده از گیاه، بسته به حلالهایی که مورد استفاده قرار میگیرد، بازدهی کمی ممکن است داشته باشد. برای مقایسه اثر AV در برابر باکتری گرم مثبت، منحیهای رشد شیگلا فلکسنری و استرپتوکوکوس پیوژنز رسم شدند. عدم رشد موثر تا 24 ساعت، با غلظتهای بیش از 100 میلی گرم AV در میلی لیتر با باکتری شیگلا فلکسنری و 25 میلی گرم AV در میلی لیتر برای باکتری استرپتوکوکوس پیوژنز بدست آمد (نمودار 2).
کاهش مقدار AV مورد نیاز برای توقف رشد این باکتری گرم مثبت به خاطر تفاوتهای ساختاری بین این دو باکتری است. تا آنجا که اطلاع داریم، این اولین مقاله درمورد حساسیت این دو باکتری به AV است. با توجه به پیچیدگیهای بررسی خواص دارویی این گیاه، آزمایشات سادهای که بتوان با تکرار کردن سادهی آنها، نسبتهای مختلف را مورد بررسی قرار داد، جهت تعیین خاصیت ضدمیکروبی ضروری است. آزمایشات بیان شده در این مقاله امکان مقایسه چندین پارامتر ساده و بررسی گونههای باکتریایی را فراهم کرد. این مطالعه مقدماتی، حساسیت باکتریهای شیگلا فلکسنری و استرپتوکوکوس پیوژنز نسبت به ژل آلوئهورا را تعیین نمود. مرحله بعدی شامل جداسازی عصاره آبی و حلال ژل آلوئه ورا و شناسایی مولکولها برای تحقیقات بیشتر است.
هرچند به نظر میرسد که خواص ژل آلوئه ورای شرکت Forever living produts و ژل آلوئهورای بازسازی شده (پودر ژل آلوئهورا) در مقایسه با اثرات NAL و AMP کمتر است، ولی اجزای موجود در آنها به تنهایی، اثرات بیشتری میتوانند داشته باشند. گلیکوزیدهای آنتراکینون و دیهیدروکسی آنتراکینون، آسمانان، و ساپونینها اجزای موثر ضدمیکروبی موجود در کل گیاه آلوئه ورا بوده و از اجزای شناختهشدهی ژل آلوئه ورا هستند. بنابراین، تحقیقات بیشتر در مورد این اجزا و سایر مولکولها، شواهد بیشتری درمورد پتانسیل درمانی ژل آلوئه ورا فراهم خواهد نمود. اثر مستقیم ژل آلوئه ورا بر روی باکتریهای موجود در مناطق تماس بدن، این امکان را ایجاد میکند که در آینده محصولاتی تولید شود که از مخاط محافظت کنند.
